Redesign of Baeyer–Villiger Monooxygenases for Synthetic Applications

Herontwerpen van Baeyer–Villiger monooxygenases voor synthetische applicaties (korte samenvatting) In het veld van biokatalyse worden enzymen toegepast om chemische reacties te katalyseren, die kunnen leiden tot efficiëntere en milieuvriendelijkere processen. Tegenwoordig is het mogelijk om eigenschappen van enzymen aan te passen met behulp van “protein engineering” methodes. Het onderzoek dat beschreven wordt in dit proefschrift, focust zich voornamelijk op het modificeren van fenylaceton monooxygenase (PAMO), een enzym dat behoort tot de Baeyer–Villiger monooxygenase familie, tot een efficiëntere biokatalyst. Allereerst, is er geprobeerd om de coenzym en substraatspecificiteit aan te passen door plaats-gerichte mutagenese. Dit resulteerde in gematigde verbeteringen van de enzymeigenschappen, maar niettemin verbeterde het onze kennis over dit type enzymen. Door het beperkte succes van onze experimenten, hebben we de focus verlegd naar alternatieve methodes en hebben we gekozen voor het ontwikkelen van een activiteitsassay om mutant collecties te kunnen screenen. Deze nieuwe activiteitsassay is gebaseerd op het gebruik van een tweede enzym dat gekoppeld is aan de activiteit van PAMO en kon worden toegepast op het screenen van een grote hoeveelheid enzym varianten. Met behulp van gedetailleerde kennis over het actieve centrum van het enzym, het katalytisch mechanisme dat voortkomt uit structurele studies, modeleren, kinetische analyses en karakterisatie van varianten is het mogelijk geworden om banken te ontwerpen van hoge kwaliteit, terwijl efficiënte screeningsmethodes het mogelijk maken om verbeterde varianten te herkennen. Deze aanpak is succesvol gebleken voor PAMO en kan worden toegepast in het herontwerpen of aanpassen van andere (Baeyer–Villiger) monooxygenases, mede doordat de ontwikkelde screeningsmethode generiek is voor NADPH-verbruikende enzymen.