Regulation of glucose metabolism in the actinomycetes amycolatopsis methanolica and streptomyces coelicolor A3(2)

Samenvatting Actinomyceten zijn Gram-positieve bacteriën die vaak als sporenvormende, filamenteuze bodembacteriën voorkomen. Actinomyceten staan bekend om het grote aantal secundaire metabolieten die ze kunnen vormen. In tegenstelling tot de primaire metabolieten zijn secundaire metabolieten verbindingen die niet noodzakelijk zijn voor de groei van een organisme. Secundaire metabolieten zijn toch belangrijke verbindingenomdat vele van deze stoffen nuttig gebruikt kunnen worden bijvoorbeeld als antibioticumtumorremmer of onkruidverdelger. Het merendeel van de, tot nog toe bekende, bacteriële secundaire metabolieten wordt geproduceerd door actinomyceten. Een hypothese is dat de synthese van secundaire metabolieten een gevolg is van een niet (goed) gereguleerd primair metabolisme. Een te hoge concentratie van intermediaren uit het primaire metabolisme zou dan omgezet kunnen worden in secundaire metabolieten. Het doel van dit promotie onderzoek was het bestuderen van de regulering van onderdelen van het glucose metabolisme in twee actinomyceten, Amycolatopsis methanolica en Streptomyces coelicolor A3(2). In eerste instantie is de aandacht gericht geweest op het bestuderen van die enzymen waarvan bekend is dat de activiteiten over het algemeen gereguleerd worden, namelijk fosfofructokinase (PFK), fosfoglyceraat mutase (PGM) en pyruvaat kinase (PK). De analyse van de glycolyse in A. methanolica heeft bijzondere aspecten onthuld. In plaats van de "gewone" ATP-PFK die normaal in bacteriën gevonden wordt is er een pyrofosfaat (PPi) afhankelijk PFK eiwit gevonden. Dit enzym werd ook in andere actinomyceten uit de familie van de Pseudonocardiaceae aangetoond. In een andere groep van de actinomyceten, de Streptomycetaceae, werd echter een ATP-PFK gedetecteerd. De PPi-PFK activiteit werd tot nog toe vaak gevonden in anaerobe bacteriën, protisten en in planten maar over het algemeen niet in aerobe bacteriën. De aanwezigheid van PPi-PFK in organismen gaat vaak samen met de aanwezigheid van andere PPi-afhankelijk eiwitten zoals fosfoenolpyruvaat carboxytransfosforylase of pyruvaat dikinase. Deze organismen hebben dan vaak een lage pyrofosfatase activiteit zodat er voldoende PPi beschikbaar is. Het goedkope afvalprodukt, PPi, vervangt het kostbare ATP in sommige enzymatische reacties hetgeen energetisch voordeliger zou kunnen zijn voor de cellen. De pyrofosfatase activiteit in A. methanolica is ongeveer even hoog als die in organismen met PPi-afhankelijke enzymen maar lager dan in organismen die deze enzymen niet bevatten. De vergelijking van de volledige aminozuurvolgorde van het PPi-PFK eiwit van A. methanolica met die van andere PFK eiwitten geeft aan dat PPi-PFK meer verwant is aan de ATP-PFK eiwitten dan aan andere tot nog toe bekende PPi-PFK ewitten. Doordat het PPi-PFK eiwit veel lijkt op het ATP-PFK eiwit van Escherichia coli kan een hypothetisch model van de drie-dimensionale structuur worden gemaakt. Met behulp van dit model konden de aminozuren die waarschijnlijk betrokken zijn bij de binding van Ppi geïdentificeerd worden. De fylogenetische analyses van PFK eiwitten maken een hypothese mogelijk over de evolutie van deze eiwitten. Er is een duidelijk beeld ontstaan dat PFK enzymen twee verschillende groepen vormen, ATP-PFK en PPi-PFK. De gemeenschappelijke voorouder van deze twee groepen zou een simpel PFK eiwit kunnen zijn dat minder strikt is in het gebruik van de fosfaatbron en waarvan de activiteit niet geremd wordt. De andere twee glycolytische enzymen die bestudeerd werden in A. methanolica zijn pyruvaat kinase (PK) en fosfoglyceraat mutase (PGM). Het PK eiwit werd gekarakteriseerd; de activiteit hiervan wordt geïnhibeerd door Pi en ATP. De PGM activiteit van A. methanolica werd geactiveerd door 2,3-bisfosfoglyceraat; de N-terminale aminozuurvolgorde van PGM1 had overeenkomsten met die van andere PGM eiwitten. Een gen uit A. methanolica, coderend voor een mogelijk PGM eiwit, werd geïdentificeerd en in E. coli tot expressie gebracht. De analyse van de PGM activiteit gaf aan dat dit eiwit inderdaad codeert voor een 2,3-bisfosfoglyceraat afhankelijkPGMeiwit,PGM2. Het molecuulgewicht van het PGM2 eiwit en de afgeleide aminozuurvolgorde zijn echter niet gelijk aan die van het gezuiverde PGM1 eiwit. De aanwezigheid van twee PGMeiwitten in A. methanolica wordt daardoor zeer waarschijnlijk. Biochemisch bewijs voor de aanwezigheid van isoenzymen van PGM eiwitten werd in bacteriën nog niet eerder gevonden. Fylogenetische analyses van 2,3-bisfosfoglyceraat afhankelijke PGM eiwitten laten zien dat er 2 groepen zijn: een groep waarin A. methanolica PGM2 samen met hypothetische PGM eiwitten aanwezig is en een tweede groep waarin PGM eiwitten van organismen aanwezig zijn waarvan de activiteit ook daadwerkelijk bewezen is. De verwachting is dat als de aminozuurvolgorde van PGM1 bekend is dat deze dan in de tweede groep terechtkomt, zoals de PGM eiwitten van Mycobacterium leprae. Verschillende enzymen die in A. methanolica noodzakelijk zijn voor de groei op methanol zijn ook noodzakelijk voor de groei op glucose. PFK, fructose-1,6-bisfosfaat aldolase en triosefosfaat isomerase zijn de overeenkomstige enzymen die glucose of methanol omzetten tot glyceraldehyde-3-fosfaat. De activiteiten van triosefosfaat isomerase en fructose-1,6-bisfosfaat aldolase zijn bij groei van A. methanolica op methanol hoger of gelijk aan de activiteiten tijdens groei op glucose. De activiteit van PPi-PFK daalde bij groei op methanol echter tot een zeer lage waarde. Tijdens de groei op methanol werd echter een ATP-PFK activiteit gevonden. Eris aangetoond dat de ATP-PFK activiteit alleen wordt geïnduceerd als de ribulosemonofosfaat cyclus noodzakelijk is voor de groei. De resultaten van de zuivering en karakterisering van dit ATP-PFK eiwit maken aannemelijk dat er een nieuw type ATP-PFK in A. methanolica aanwezig is. De regulering van de activiteit door PPi, ADP en fructose-2,6-bisfosfaat werd nog niet eerder in bacteriën aangetoond. De aminozuurvolgorde van de N-terminale aminozuren en de aminozuurvolgorde van een intern peptide fragment zijn niet gelijk aan die van bekende PFK eiwitten. A. methanolica is de eerste bacterie waarin zowel een PPi-PFK als een ATP-PFK eiwit is aangetoond. De fysiologische rol van ADP inhibitie zou kunnen zijn dat bij een laag energie niveau in de cel (hoge ADP/ATP ratio), het ATP-PFK wordt geremd zodat meer formaldehyde kan worden gedissimileerd. Hierdoor kan meer energie worden verkregen nodig voor assimilatie van formaldehyde in celmateriaal. De rol van fructose-2,6-bisfosfaat is nog onduidelijk. Momenteel is er nog geen hard bewijs voor de aanwezigheid van fructose-2,6-bisfosfaat in A. methanolica of in andere bacteriën. Uit het tweede bestudeerde organisme, de actinomyceet S. coelicolor A3(2), werd het PFK eiwit gezuiverd en gekarakteriseerd. Dit enzym is afhankelijk van ATP en de activiteit wordt geremd door fosfoenolpyruvaat. Het gen coderend voor het ATP-PFK eiwit werd gekloneerd en geanalyseerd. De volgorde van de aminozuren heeft een zeer grote overeenkomst met die van het PPi-PFK eiwit van A. methanolica. Het blijft echter onduidelijk waarom dit enzym specifiek is voor ATP en geremd wordt door fosfoenolpyruvaat terwijl de PPi-PFK van A. methanolica geen ATP gebruikt en niet wordt geremd door fosfoenolpyruvaat. Deze grote verschillen in eigenschappen en de kleine verschillen in de aminozuurvolgorde maken het mogelijk om de essentiele verschillen die PPi en ATP specificiteit en PEP (on)gevoeligheid bepalen nader te onderzoeken. Uit dit onderzoek blijkt dat de glycolyse van S. coelicolor A3(2) wel degelijk wordt gereguleerd (ATP-PFK) en dat de productie van secundaire metabolieten niet een simpel gevolg is van overflow metabolisme.De bestudering van andere enzymen uit de glycolyse van S. coelicolor A3(2) zal meer inzicht kunnen geven in de aanwezigheid van additionele reguleringsstappen.