Expression and functional characterization of membrane proteins

Verschillende stadia van functionele analyse van membraaneiwitten Het onderzoek van Nadia Gul legt de focus op de verschillende stadia van functionele analysis van membraaneiwitten. Een deel van de membraaneiwitten zijn zogeheten ionenkanalen, pompen voor ionen en opgeloste stoffen en transporters voor opgeloste stoffen en enzymen. Deze eiwitten regelen veel cellulaire processen en voeren een verscheidenheid aan fysiologische functies uit, waaronder de opname van voedingsstoffen, het uitscheiden van afvalstoffen en communicatie, zowel binnen de cel als tussen cellen. De lage natuurlijke expressie en het hydrofobe karakter van membraaneiwitten maakt het moeilijk ze te bestuderen. Vanwege deze eigenschappen zijn de overexpressie van correct gevouwen en functionele membraaneiwitten en de functionele integratie van deze eiwitten in artificiële membraansystemen belangrijke uitdagingen in het veld van de membraan biologie. Gul beschrijft onder andere een methode om E. coli stammen te ontwikkelen en te selecteren voor stammen met een verhoogde expressie van membraaneiwitten, die in Guls proefschrift NG-stammen genoemd zijn. Sequencing van het gehele genoom van deze NG-stammen wees uit dat er mutaties zijn opgetreden in de genen hns, dcm, cpxA, ung, ydcU en/of yffN. Opmerkelijk was dat het hns gen in alle stammen gemuteerd bleek te zijn. Daarnaast beschrijft Gul in haar proefschrift de zuivering en functionele integratie van de ABC-transporter ProU in een artificieel membraansysteem genaamd liposomen. Voor het uitvoeren van functionele in vivo studies aan ProU werd het oplosbare substraatbindende domein ProX gekloneerd en geproduceerd met een signaal anker sequentie van het eiwit OppA. Dit gaf de mogelijkheid tot efficiënte lipide modificatie van de N-terminus van ProX en daarmee verankering van het eiwit aan een membraan. De activiteit van ProU werd bepaald in hele cellen en in proteoliposomen door gebruikt te maken van ATP als energiebron en glycine betaine als substraat. Verder behandelt Gul de rol van de N-terminale amfipathische α-helix in de activiteit van een andere ABC-transporter genaamd OpuA. Haar onderzoek heeft uitgewezen dat de aanwezigheid van deze amfipatische α-helix een vereiste is voor volledige transportactiviteit. FRET analyse heeft laten zien dat de helix zich dicht bij het oppervlak van het membraan bevindt.