Quantification of macromolecular crowding and ionic strength in living cells

De intracellulaire omgeving verschilt van het extracellulaire milieu door de hoge dichtheid in macromoleculen. Deze hoge dichtheid aan macromoleculen, macromoleculaire crowding genoemd, kan worden gekwantificeerd met intracellulaire eiwit-gebaseerde sensoren. De mate van crowding wordt bepaald door Förster resonance energy transfer (FRET) tussen twee verschillende fluorescente eiwitten aan de sensor. In dit proefschrift helder ik het mechanisme van crowding sensing op, waarbij duidelijk wordt dat de sensoren zich gedragen als polymeren en dat hun compressie gerelateerd is aan hun grootte en de crowderconcentratie. In cellen is de compressie eveneens afhankelijk van de structuur van de linkerregio in de sensor, wat een belangrijk verschil vormt tussen in vitro en in vivo experimenten. Ik heb een afwijking geïdentificeerd vanwege de langzame maturatie van fluorescente eiwitten en dit opgelost door de expressie van de sensor onder een constitutieve promotor te plaatsen. Door crowding te volgen in Escherichia coli hebben we ontdekt hoe crowding verandert in cellen. Eveneens hebben we de eerste sensoren ontwikkeld om de ionische sterkte in levende cellen te bepalen. Deze sensoren om crowding en ionische sterkte te bepalen stellen ons in staat de fysicochemische aspecten in de cel te begrijpen en dienen als eerste stap om de rol van fysisch-chemische parameters op de biochemische organisatie en fysiologie van de levende cel op te helderen.